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    如何做非肌肉肌球蛋白的層析純化？

    發(fā)布時間： 2021-11-24　　點擊次數(shù)： 1210次

    材料與儀器

    非肌肉肌球蛋白
    勻漿緩沖液 肌動蛋白聚合緩沖液 凝膠過濾 羥基磷灰石緩沖液 GF HT 緩沖液
    大容量轉(zhuǎn)頭

    步驟

    高速離心和 DEAE 層析

    1. 用不含除了 PMSF 以外的蛋白水解抑制劑的勻漿緩沖液平衡 DEAE 纖維素，取 50 ml 裝到 2.5cm x 35cm 有合適管路的柱子上。

    2. 準(zhǔn)備總體積為 0.8 L，線性梯度為 0~0.5 mol/L KCl 的勻漿緩沖液。

    3. 用大容量轉(zhuǎn)頭（例如 Ti 647.5，它帶 6 個 70 ml 容量的聚碳酸酯桶）以 43000 r/min，137600 g 超速離心 2 小時，從已勻漿的細(xì)胞中沉淀細(xì)胞碎片。

    4. 盡可能多地轉(zhuǎn)移清亮的上清，不要弄碎沉淀和浮在表面的白色脂肪殘渣。

    5. 混合 100 ml 上清和 100 mI DEAE-纖維素（已如上所述用勻漿緩沖液預(yù)先平衡）可以一次性地把清亮的上清樣到 DEAE 上。DEAE-蛋白混合物倒進 2.5cm x  35cm 的預(yù)先裝了 50 ml 用勻漿緩沖液和 PMSF平衡的 DEAE-纖維素的柱子。

    6. 立即開始分部收集（每管 8.5 ml )。

    7. 用 3~5 倍體積的勻漿緩沖液洗柱子，用 0.8~1 升 KCl 梯度為 0~0.5 mol/L 的勻漿緩沖液進行洗脫。

    8. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性（K+EDTA 或 Ca2+ 活性峰）、SDS-PAGE、免疫印跡、ELASA 或放射標(biāo)記及固相結(jié)合分析.

    9. 把從 DEAE 層析得到的含肌球蛋白的收集液混合在一起。

    非肌肉肌球蛋白和外源肌肉肌動蛋白共沉淀

    10. 準(zhǔn)備下列貯存液。

    1 mol/L KCl

    0.1 mol/L MgCl2

    溶于不含 ATP 的肌動蛋白聚合緩沖液的 30% 蔗糖墊層：

    300 mg/ml 蔗糖

    50 mmol/L KCl

    2 mmol/L MgCl2

    10 mmol/L 嘧唑-HCl，pH 7.0

    11. 計算所需的外源肌動蛋白量，使混合的 DEAE 收集液中肌動蛋白的終濃度為 0.125 mg/ml。所需肌動蛋白體積(ml)由下式給出：

    VA= ( 0.125 x Vpool）/ [ ( 肌動蛋白）-0.125]

    ( 肌動蛋白）是在緩沖液 A 中 G-肌動蛋白貯存液的濃度，單位 mg/ml。

    12. 量出所需 G-肌動蛋白的量（使用 1~8 mg/ml 溶于緩沖液 A 中的肌動蛋白，用肌動蛋白制備中所述的方法獲得），并通過和適當(dāng)體積的 50x 肌動蛋白聚合緩沖液（所加的體積=VA/50）混合并在室溫培養(yǎng) 10~20 分鐘來使它聚合。

    50x 肌動蛋白聚合緩沖液：

    2.5 mol/L KCl

    1 mol/L MgCl2

    3 mmol/L NaN3

    13. F-肌動蛋白和 DEAE 收集液混合（步驟 9 )，使 MgCl2 濃度為 2 mmol/L。

    14. 加入足量的 1 mol/L 葡萄糖使終濃度為 50 mmol/L ( 加 50 μl/ml )，然后加己糖激酶使終濃度為 1 單位/ml（0.25 μl/ml）。室溫下攪拌 5 分鐘，然后轉(zhuǎn)移到 0℃ 過夜（幾小時可能就足夠了）。

    15. 在超速離心管中裝 1/3 溶于不含 ATP 的肌動蛋白聚合緩沖液的 30% 蔗糖墊層，把含僵硬的肌動球蛋白復(fù)合物的樣品鋪到墊層上面。離心 3 小時沉淀肌動球蛋白。

    通過不連續(xù)凝膠過濾從外源肌動蛋白中分離肌球蛋白

    16. 準(zhǔn)備用于凝膠過濾的貯存液和材料

    4x 凝膠過濾/羥基磷灰石緩沖液：

    200 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0

    20% 蔗糖

    8 mmoI/L K+EDTA，pH 7.0

    12 mmol/L NaN3

    可以貯存在 4℃。

    2x GF/HT 緩沖液：

    4X GF/HT 緩沖液，100 ml

    0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0，10 ml   

    DTT，62 mg

    用 dH2O 加到 200 ml 。

    KI 凝膠過濾緩沖液：

    2x GF/HT 緩沖液，20 ml

    Kl，4.78 g

    用 dH2O 加到 40 ml。

    KCl 凝膠過濾緩沖液：

    2x CF/HT 緩沖液，180 ml

    KCl，16.10 g

    用 dH2O 加到 360 ml。

    17. 備一個 1.5 x 85 cm 的用 KCl 凝膠過濾/羥基磷灰石緩沖液平衡了的 A15-m 瓊脂糖凝膠過濾柱。

    18. 離心步驟結(jié)束的時候，在凝膠過濾柱上加 12~19 ml KI 緩沖液。

    19. 倒掉上清和蔗糖，留下肌動球蛋白沉淀物，然后在冰庫中把管子倒轉(zhuǎn)在紙巾上 5~10 分鐘，小心地使液體流干。用棉簽去掉多余的液體。

    20. 處理沉淀：

    (1) 用不銹鋼刮刀挖出沉淀。

    (2) 在 4.3 ml KI 緩沖液中用一個 7 ml 的帶緊的研杵的 Dounce 勻漿器進行勻漿。

    (3) 超速離心（50Ti 轉(zhuǎn)頭，30000 r/min 63400 g）30 分鐘使樣品變清。

    (4) 仔細(xì)地轉(zhuǎn)移上清，不要帶任何沉淀碎片。

    (5) 立即把樣品加到凝膠過濾柱上并用 KCI 凝膠過濾緩沖液跑柱子。

    21. 分析柱子中肌球蛋白的 ATP 酶活性、SDS-PAGE、免疫印跡、ELASA 或放射標(biāo)記及固相結(jié)合分析。混合含肌球蛋白的收集液。洗脫天然肌球蛋白-II 的分配系數(shù)應(yīng)該是 0.13~0.14。

    羥基磷灰石層析

    22. 準(zhǔn)備進行羥基磷灰石層析的貯存液和材料。

    預(yù)先在 GF/HF 緩沖液中平衡了的羥基磷灰石（2~4 ml）

    線性梯度，總體積 20~40 ml 的 GF/HF 緩沖液，0~300 mmol/L K+PO4，pH 7.0

    0.6 mol/L K+PO4，pH 7.0

    23. 準(zhǔn)備一個 1x 5 cm 的有合適管路的柱子。

    24. 對收集液的進一步純化是重復(fù)肌動蛋白親和及凝膠過濾步驟或接著用經(jīng)基磷灰石層析。

    25. 收集液和預(yù)先平衡好的羥基磷灰石（每毫升羥基磷灰石 12~20 ml 收集液）混合在一起，然后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜（短一點時間可能也夠）。

    26. 把蛋白/羥基磷灰石混合物倒到一個小柱子（1x5 cm) 中，用 5~10 倍體積的 CF/HF 緩沖液洗，然后用總體積 20~40 ml 的 GF/HF 緩沖液，0~300 mmol/L K+PO4 線性梯度，pH 7.0 洗脫。肌球蛋白Ⅱ在大約 200~220 mmol/L K+PO4，pH 7.0 處洗脫下來。


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